The main goal of the present project is the elaboration of biochemical criteria for the selection of plants according to their ability to absorb and deeply degrade hydrocarbons, which is the basis of a new strategy of environmental phytoremediation and maintenance of the ecological balance.
The beginning of the XXI century is characterized by a clearly expressed tendency of enhanced contamination of the environment. As a result of chemical synthesis several million tons of chemicals are annually produced in the world. The huge amount of these chemicals is concentrated in biosphere and significantly affects the ecological balance.
Recent investigations of the molecular mechanisms of pollutant detoxification by plants and microorganisms have been intensively studied (Salt, D.E., Smith, R.D. and Raskin, J. Phytoremediation. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998, 49, 643-668). Phytoremediation, based on plants’ ability to absorb and transform a wide spectrum of organic toxicants, including aliphatic and aromatic hydrocarbons of natural gas and oil, is a cost-effective and advanced ecotechnology (Glass, D.J. Current Market Trends in Phytoremediation. International Journal of Phytoremediation, 1999, 1, 1-8). In contrast to existing technologies of environment purification, phytoremediation provides considerable remediation, ensuring maintenance of the natural ecological balance (Korte, F., Kvesitadze G., et al., Review: Organic toxicants and plants. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2000, 47, 1-26). One of the main advantages of phytoremediation, as a wide scale industrial technology, consists in the following: as a result of deep enzymatic degradation to CO2 or cell regular metabolites, all carbon atoms of the pollutants participate in carbon natural circulation.
The efficiency of technologies based on plants’ phytoremediational characteristics is defined by a plant’s ability to degrade toxicant molecule to carbon dioxide. Such potential is characteristic for plants with a full set of enzymes, participating in the processes of toxicant oxidative degradation.
By coordinated action of oxidative enzymes, the degradation of the carbon skeleton of a toxicant to standard cell metabolites is achieved. These enzymes – cytochrom P450-containing monooxygenase, peroxidase and phenoloxidase are those marker proteins, which mainly determine a plant’s detoxificational potential.
For the last 40 years, the Durmishidze Institute of Biochemistry and Biotechnology, Academy of Sciences of Georgia, has studied molecular mechanisms of detoxification of organic pollutants, particularly: aliphatic, aromatic, including polycyclic aromatic carcinogenic hydrocarbons, pesticides of different classes, nitrogen-containing organic compounds, etc, by plants.
Over 130 publications were devoted to the investigation of this problem. Proteins, the primary products of coding loci of genomous DNA, define peculiarities of metabolism in plants. They are reliable criteria for evaluation of the functional significance of genes responsible for their synthesis. Therefore, exposure of direct products of plant growth genes, expressible at definite conditions – proteins in the electrophoretic spectra, functionally linked with the hydrocarbons’ oxidative degradational potential, allows fast and reliable selection of the most promising plants for phytoremediation purposes. At the same time the results of these investigations could be successfully used for recombinant DNA manipulations, for the creation of new plant varieties with increased ecological potential.
Project realization will advance basic understanding of the transformation and detoxification of organic xenobiotics in plants.
Expected results
· To reveal the plant varieties, which actively absorb and degrade hydrocarbons to carbon dioxide or standard cell intermediates.
· To elucidate molecular mechanisms of hydrocarbon degradation in higher plants, consisting of consecutive enzymatic oxidative reactions for hydrocarbons of different chemical structure and to state the toxicity of formed intermediates.
· To determine the protein spectra of plants characterized by increased or slightly expressed ability of hydrocarbon degradation. To state the existence of proteins – markers, responsible for deep metabolic transformation of hydrocarbons.
· To work out biochemical criteria for the fast selection of plants for phytoremediational purposes, according to their ability to conduct deep degradation of hydrocarbons.
· To elaborate a new strategy of phytoremediation, consisting of purposeful selection of plants on the basis of biochemical criteria.
The practical significance of these results consists in the use of the elaborated method of plant selection for their successful application in phytoremediation technologies.
Meeting ISTC goals
According to the goals and objectives of the ISTC, 57% of so-called “weapons scientists” will participate in realization of this peaceful project - fundamental/applied research in environmental protection.
Practical implementation
The project has national as well as international significance. The experimental results of the project will facilitate the solution of a problem connected with the danger of environmental pollution in Georgia with hydrocarbons at realization of the international projects: Baku-Tbilisi-Ceyhan Main Export Oil Pipeline, Supsa Oil Terminal. The project will contribute to ecological security of the Eurasian Transport Corridor (TRASECA).
Taking into account that territories around gas and oil-pipelines, highways and railroads, and proving grounds all over the world are contaminated by the same pollutants, it is obvious that the new strategy of phytoremediation could be successfully used in other countries worldwide.The implementation of the project envisages the execution of the following tasks:
1. To reveal plants, capable of actively absorbing gaseous (C1-C4) and liquid (C5-C8) alkanes and aromatic hydrocarbons (benzene, toluene, benzo[a]pyrene, naphtalene).
2. To state pathways of hydrocarbon oxidative degradation to carbon dioxide or regular endogenous compounds.
3. To establish activities and possibilities of induction of oxidative enzymes – cytochrom P450-dependent monooxygenase, peroxidase and polyphenoloxidase in plants with deep degradation ability of hydrocarbons.
4. To investigate the effect of different concentrations of hydrocarbons on metabolic and energetic processes and the ultrastructural organization of a plant cell.
5. On the basis of conducted investigations, to reveal proteins, as a markers of plants characterized by high potential to conduct deep metabolic transformation of hydrocarbons.

The study of plants’ ability to absorb and degrade hydrocarbons will be carried out by the method of radioactive indication using radioactive preparations labeled by carbon 14C. This well approved method allows most precise determination of the degree of hydrocarbon absorption, and the depth of degradation of the carbon skeleton.

The hydrocarbon transformation will be carried out by the methods of thin-layer, gas-liquid and high performance liquid (HPLC) chromatography, IR and UV spectroscopy.

Вторая половина прошедшего столетия характеризуется четко выраженной тенденцией повышения химического загрязнения окружающей среды. Только путем химического синтеза в мире ежегодно производятся десятки миллионов тонн соединений разной структуры. Разными путями эти вещества в колоссальных количествах концентрируются в биосфере и значительно влияют на экологическое равновесие.

В последнее время исследования молекулярных механизмов обезвреживания токсических соединений растениями и микроорганизмами проводятся с целью биоремедиации окружающей среды (Salt D.E., Smith RD. and Raskin J. Phytoremediation. Annu. Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 1998, 49, 643-668). Фиторемедиация, которая опирается на способность растений поглощать и превращать широкий спектр органических токсикантов, включая алифатические и циклические углеводороды природного газа и нефти, является экономной и эффективной экобиотехнологией. (Glass, D.J. Current Market Trends in Phytoremediation. International Journal of Phytoremediation 1999, 1, 1-8). В отличие от существующих технологий очистки окружающей среды, этим путем достигается ее значительное оздоровление без нарушения ее естественного состояния (Korte F., Kvesitadze G., et al. Review: Organic Toxicants and Plants. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 47, 1-26). Одним из основных преимуществ технологий основанных на фиторемедиационных принципах заключается в следующем, в результате глубокой ферментативной деградации до углекислого газа или обычных клеточных метаболитов все углеродные атомы токсиканта вовлекаются в естественный круговорот углерода.

Основная цель представленного проекта – создание биохимических критериев для оценки растений по их способности поглощать и осуществлять глубокую деградацию углеводородов, что является основой для разработки новой стратегии фиторемедиации окружающей среды и сохранения экологического баланса.

Эффективность технологий, основанных на фиторемедиационных свойствах растений, определяется способностью последних осуществлять деградацию молекулы токсиканта до углекислого газа. Такими свойствами характеризуются растения, обладающие полным набором ферментных систем, участвующих в окислительных процессах трансформации токсикантов.

Координированным действием окислительных ферментных систем достигается деградация углеродного скелета токсиканта до стандартных метаболитов клетки. Именно эти ферменты – цитохром Р450-содержащая монооксигеназа, пероксидаза и фенолоксидаза представляют собой те маркерные белки, которые определяют детоксикационный потенциал растений.

В Институте биохимии и биотехнологии им. С. Дурмишидзе АН Грузии почти 40 лет изучаются молекулярные механизмы детоксикации растениями органических соединений – загрязнителей биосферы, в частности: алифатических, ароматических, в том числе полициклических ароматических, канцерогенных углеводородов, пестицидов разных классов, азотсодержащих органических соединений и др.

По вышеуказанным вопросам опубликовано свыше 130 научных работ, среди которых следует отметить:

1. Угрехелидзе Д.Ш. Метаболизм экзогенных алканов и ароматических углеводородов в растениях (Ред. С.В. Дурмишидзе). Мецниереба. Тбилиси, 1976.

2. Угрехелидзе Д.Ш., Дурмишидзе С.В. Поступление и детоксикация органических ксенобиотиков в растениях (Ред. Т.И. Митайшвили). Мецниереба. Тбилиси, 1984.

3. Khatisashvili, G., Kurashvili, M., Gordeziani, M., Kvesitadze, G. Monooxygenase and peroxydase pathways of xenobiotics detoxication in higher plants. Fresenius Environmental Bulletin, 1993, 2, 103-108.

4. Ugrekhelidze, D., Korte, F., Kvesitadze, G. Uptake and transformation of benzene and toluene by plant leaves. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1997, 37, 24-28.

5. Ugrekhelidze, D., Kvesitadze, G. Assimilation and metabolism of methane by higher plants. Fresenius Environmental Bulletin, 1997, 6, 740-748.

6. Buadze, O., Kvesitadze, G. Effect of low-molecular-weight alkanes on the plant cell photosynthetic apparatus. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1997, 38, 36-44.

7. Khatisashvili G., Gordeziani M., Kvesitadzeм, Korte F. Plant monooxygenases: participation in xenobiotic oxidation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 1997, 36, 118-122

8. Buadze, O., Sadunishvili, T., Kvesitadze, G. The effect of 1,2-benzantracene and 3,4-benzpyrene on the ultrastructure of maize cells. International Biodeterioration and Biodegradation, 1998, 41, 119-125.

9. Gordeziani, M., Khatisashvili, G., Ananiashvili, T., Varazashvili, T., Kurashvili, M., Kvesitadze, G. Tkhelidze P. Energetic significance of plant monooxygenase individual components participating in xenobiotic degradation. International Biodeterioration and Biodegradation, 1999, 44, 49-54.

10. Zaalishvili, G., Khatisashvili, G., Ugrekhelidze D.,Gordeziani, M., Kvesitadze G. Plant potential for detoxification (Review). Applied Biochemistry and Microbiology. 2000, 36, 443-451.

11. Korte, F., Kvesitadze G., Ugrekhelidze D., Gordeziani, M., Khatisashvili, G. Buadze, O. Zaalishvili, G., Coulston, F. Review: Organic toxicants and plants. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2000, 47, 1-26.

Белки как первичные продукты кодирующих локусов геномной ДНК определяют метаболические особенности организма. Они являются надежными критериями в оценке функционального значения генов, ответственных за их синтез. Поэтому, выявление прямых продуктов деятельности экспрессируемых в определенных условиях роста растений генов белков в электрофоретическом спектре, функционально связанных со способностью окислительной деградации углеводородов, позволяет быстро и надежно отбирать самые перспективные растения для фиторемедиационных целей. Результаты этих же исследований могут быть использованы для генноинженерных манипуляций связанных с выведением новых растений характеризующихся повышенным экологическим потенциалом.

Настоящий проект является фундаментальным исследованием и в то же время носит ярко выраженный прикладной характер. Реализация проекта позволит получить более полные сведения о фундаментальных аспектах превращения и детоксикации органических ксенобиотиков в растениях, а именно:

– Выявить те виды растений, которые способны активно поглощать и разлагать углеводороды до углекислого газа или стандартных клеточных метаболитов, т.е. осуществлять глубокую деградацию токсиканта.
– Выяснить молекулярные механизмы деградации углеводородов различной химической структуры в высших растениях, заключающиеся в установлении последовательных ферментативных окислительных реакций и степени токсичности образуемых промежуточных продуктов.
– Установить белковый спектр растений, характеризующихся высокой или слабо выраженной способностью разлагать углеводороды. Выявить белки – маркеры, ответственные за глубокие метаболические превращения углеводородов.
– Разработать биохимические критерии оценки и методы отбора растений не требующие длительного времени, по их способности осуществлять глубокую деградацию углеводородов.
– Разработать новую стратегию фиторемедиации, заключающуюся в целенаправленном подборе растений на основе биохимических критериев.

Практическое значение проекта заключается в установлении биохимических критериев быстрой оценки при помощи которых можно отбирать растения для их успешного применения в фиторемедиационных технологиях.

Согласно целям и задачам МНТЦ, 57% т.н. «оружейные ученые» будут участвовать в осуществлении настоящего мирного проекта, посвященного защите окружающей среды.

Учитывая, что близлежащие территории нефте- и газопроводов, шоссейных и железных дорог, а также военно-учебные полигоны во всех странах загрязняются примерно одними и теми же соединениями, очевидно, что разработанный новый подход к фиторемедиации может успешно применятся и другими странами.

Для достижения намеченной цели, будут решены следующие задачи:

– Выявлены растения, способные активно поглощать газообразные (С₁-С₄) и жидкие (С₅-С₈) алканы и ароматические углеводороды (бензол, толуол, бензапирен, нафталин).Установлены пути окислительной деградации углеводородов до углекислого газа или стандартных эндогенных соединений.
– В растениях, способных осуществлять глубокую деградацию углеводородов будут определены активности окислительных ферментов и возможности индукции цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, пероксидазы и полифенолоксидазы.
– Выявлены влияния разных концентраций углеводородов на основные метаболические и энергетические процессы и ультраструктурную организацию растительной клетки.
– На основании проведенных исследований будут установлены белки/ферменты как маркеры растений характеризующихся повышенной способностью осуществлять глубокие метаболические превращения углеводородов.

Роль зарубежного коллаборатора в проекте заключается в: совместном составлении плана работ; обсуждении экспериментальных данных; участии в рабочих семинарах; приготовлении совместных публикации; предоставлении комментариев к техническим отчетам.

Установление поглощения и окислительного превращения растениями углеводородов, а также идентификация образовавшихся промежуточных и конечных продуктов будет проводится методами радиоактивной индикации, тонкослойной, газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, ИК и УФ спектрофотометрии.

Активности пероксидазы, фенолоксидазы и монооксигеназы, глутамат- и малатдегидрогеназ и глутаминсинтетазы будут определены спектрофотометрическими и полярографическими методами. Ультраструктурная организация клеток будет исследована с помощью электронного микроскопа.

Поиск и выявление маркерных белков а также изоферментов будет проводится методами гель-электровореза и изоэлектрического фокусирования. Для анализа электрофоре грамм будет создана база данных и разработана математическое обеспечение.